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当前位置:水产资料 → FSI,抗鱼类神经坏死 今天是:2019年05月23日 星期四

FSI,抗鱼类神经坏死病毒卵黄抗体的特性分析

出处:水生动物健康评估 作者: 水产养殖网 2019-04-07 22:35:00

今天与大家分享一篇来自Fish & Shellfish Immunology上的文章,抗鱼类神经坏死病毒卵黄抗体的特性分析,文章引用信息如下:
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神经坏死病毒 (nervous necrosis virus, NNV) 是病毒性神经坏死症 (viral nervous necrosis, VNN) 的主要传染病原,感染多种海水和淡水鱼类,在鱼苗期的致死率可高达 100%,严重制约着鱼类养殖业的健康发展。由于鱼苗特异性免疫系统发育不全,目前对于感染 NNV 的幼鱼尚无有效的病毒防治措施。
卵黄免疫球蛋白 (Immunoglobulin of yolk, IgY) 来源于卵生动物,经血清转移并富集至卵黄中,具有产量高、成本低和理化性质稳定的特点,广泛应用于被动免疫,尤其是免疫系统尚未发育完全的幼仔。本研究克隆并表达了赤点石斑神经坏死病毒 (Red-spotted grouper nervous necrosis virus, RGNNV) 的重组衣壳蛋白,并将其作为抗原免疫产蛋母鸡制备特异性抗 RGNNV 的卵黄抗体。
实验结果如下:
1. 抗原的制备和母鸡的免疫
克隆RGNNV衣壳蛋白并连接到pGEX-5X-1表达载体上,大量表达GST融合蛋白,随后通过沉淀-洗涤-透析等过程对GST融合蛋白进行纯化。
 将健康的海兰褐蛋鸡随机分为两组,给予充足的饲料和水源饲养一周并观察。生长、饮食等情况良好,产蛋 5-7 枚/周,进行免疫。间隔两周进行一次加强免疫,共进行 3 次免疫。收集从第一次免疫后每天的鸡蛋,编号做好标记后 4 ℃保存备用。
免疫途径为胸肌、翅膀分点,第一次免疫使用的佐剂为完全弗氏佐剂(等体积混合),后两次免疫使用的佐剂为不完全弗氏佐剂(等体积混合),免疫剂量均为400 µg / 只 。

2. 抗 RGNNV 卵黄抗体的制备和效价。
采用水稀释法分离鸡蛋中的卵黄抗体,两步硫酸铵盐析法进行纯化。ELISA 检测显示首次免疫后第六周抗 RGNNV 卵黄抗体效价达到最高值。最高效价可达 1:51200,卵黄抗体可持续保持高效价数周。

3. 抗 RGNNV 卵黄抗体的免疫保护作用。
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将 0.05、0.1、0.2、0.5 mg/mL 特异性卵黄抗体或非特异性卵黄抗体与 1.0 MOI RGNNV 于 28 ℃共孵育 2 h 后,将 IgY-病毒混合液感染 GF-1 细胞,未感染的 GF-1细胞作为阴性对照,感染未孵育病毒的 GF-1 细胞作为阳性对照。3-5 天后,观察细胞状态,待阳性对照组细胞出现明显病变时收集细胞蛋白样品。
经Western blot 分析后发现,与阳性对照组相比,0.05 mg/mL 特异性 IgY 与 RGNNV 孵育后,病毒在 GF-1 细胞内增殖能力下降到 41.8%,当浓度高于 0.1 mg/mL 特异性IgY 与 RGNNV 孵育后,可以完全中和病毒,100%保护 GF-1 细胞抵御 RGNNV 的感染。而不同浓度的非特异性 IgY 与病毒共孵育后,病毒在 GF-1 细胞中的增殖能力没有显著差异。证明抗 RGNNV 卵黄抗体可以有效地中和 RGNNV 且具有剂量依赖性,对 GF-1 细胞起到免疫保护的作用。

4. 卵黄抗体的稳定性。
抗 RGNNV 卵黄抗体在 70 ℃以下、pH=2-10、及胃蛋白酶消化 (pH=3-10) 的条件下可以保持相对稳定的活性。经 30-60 ℃ 加热处理或 pH (2-10)处理及胃蛋白酶消化 (pH=3-10) 的抗 RGNNV 卵黄抗体仍可以完全抑制 RGNNV 在GF-1 细胞中增殖,但在 pH=2 的环境下胃蛋白酶消化处理的特异性卵黄抗体与病毒的中和能力有所减弱。证明卵黄抗体具有较稳定的耐高温、耐酸碱、耐胃蛋白酶消化的特点。
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小结:
鱼类神经坏死病毒作为鱼类神经坏死症的致病病毒,主要感染特异性免疫系统尚未发育成熟的仔鱼和稚鱼,目前暂无有效的商业化防治措施。利用卵黄抗体技术对易感染鱼苗实行被动免疫,可能是一种新型的防治手段。
神经坏死病毒的衣壳蛋白作为病毒编码的唯一结构蛋白,在侵染宿主过程中起到重要作用,具有较强的免疫原性。因此本实验制备了抗神经坏死病毒衣壳蛋白的卵黄抗体,验证结果显示 IgY 对病毒衣壳蛋白具有高度亲和力和特异性。在 GF-1 细胞水平上探究发现,浓度高于 0.1 mg/ml 的特异性 IgY 与病毒共孵育后,可以成功中和病毒,抑制病毒增殖,实现对细胞的免疫保护。特异性 IgY 对石斑鱼苗体内的免疫保护效果还有待进一步探究。

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