论文解读--尼罗罗非鱼MyD88 基因荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 出处：水生动物健康评估公众号 作者：陆枝 水产养殖网 2019-10-15 23:32:00 |
髓样分化因子(myeloiddifferentiation factor 88，MyD88) 是天然免疫反应中一类重要模式识别受体-Toll 样受体(Toll-like receptors, TLRs)信号通路中的接头蛋白，是信号向下游传导的关键靶分子。MyD88现已在多个物种中分离鉴定出来，并检测到其在心、肝、肾、脾、肌肉和血液等组织中普遍表达， MyD88 有着重要的生物学功能。实验研究选择实时荧光定量PCR技术作为试验的技术途径，以β-actin 基因为内参，建立尼罗罗非鱼MyD88荧光实时定量检测平台。
实时定量PCR技术具有灵敏度高、特异性强、简便快速、安全可靠等优点，已被广泛应用于动物医学病理和分子生物学研究领域。在实时定量反应中，起关键作用的是能够散发荧光的探针或染料，它能与dsDNA结合，通过信号收集可以实时展现定量扩增情况。所用荧光染料SYBR GreenⅠ是一种结合于DNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，可应用于任何反应体系，方法简便且经济实惠。由于它可以和任何DNA双链分子结合，因此反应完成后必须进行熔解曲线的测定，以判定是否有非特异性产物和引物二聚体，并据此对引物及反应体系进行优化。
总RNA的完整性
经紫外分光光度计检测，RNA样品A260/A280值均在1.98~2.0 之间。琼脂糖凝胶电泳结果显示（图1），5 S、18 S和28 S带型完整，说明样品没有发生降解，质量良好，能满足后续实验操作的要求。
扩增结果
目的基因MyD88 和内参基因β-actin 的定量扩增曲线如图2 所示，均呈典型的S 型，模板浓度越高，CT值越小，随着扩增循环数的增加，荧光信号逐渐增强，当循环数达到一定程度时，荧光强度达到平台；MyD88 和β-actin 基因标准曲线CT值检测范围分别为24~35 和19~30，均在有效线性范围区间。
熔解曲线分析显示（图3），MyD88 和β-actin的熔解曲线分别在78.5℃、77.5℃处形成单一的特异峰，熔解温度均一，且峰位于5℃范围内，无特异性荧光，PCR反应产物纯度好。
通过4%琼脂糖凝胶电泳检测，MyD88 和β-actin基因实时定量PCR 扩增产物分别在约70 bp 和55 bp 处得到单一的扩增条带。测序结果表明，扩增产物的长度分别为67 bp 和57 bp，核苷酸序列BLAST 检索证实为尼罗罗非鱼MyD88 和β-actin 基因的部分序列。
从扩增数据结果（表2）来看，除肌肉组织MyD88 表达量极低外（CT 值>35），实验中测定的MyD88 和β-actin 荧光定量PCR反应CT 值范围均在15~30 之间，且数值集中；平均CT 标准差小于0.27，变异系数小于1.0%，标准差和变异系数都较小。通过组织定量分析结果来看，健康尼罗罗非鱼体内MyD88在肝脏和脾脏中表达量最高，在血液中次之，在肌肉中表达量最低。
R2 分别为0.998 和0.995，表明标准曲线线性度好，误差小；E 分别为-3.320 和-3.404，在较好的范围区间，大大降低了由于扩增效率过低而高估各组织MyD88相对差异的影响。MyD88 和β-actin 基因标准曲线斜率差小于0.1，可认为其扩增效率基本一致，满足应用2−ΔΔCt进行相对定量分析尼罗罗非鱼MyD88表达的条件。
据Pfaffl报道，当实时荧光定量PCR 扩增CT值变异系数小于2.5%时，定量反应结果可靠。在尼罗罗非鱼组织相对定量PCR检测中，MyD88 和β-actin荧光定量PCR 反应平均CT值变异系数小于1.0%，表明所建立的实时检测MyD88 基因在不同组织中的表达重复性好。
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