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论文解读--鰤鱼诺卡氏菌重组HRP1对加州鲈的保护作用

出处:水生动物健康评估 作者:陈国权 水产养殖网 2020-04-17 11:37:00

今天和大家分享一篇来自Vaccine的文章:鰤鱼诺卡氏菌重组HRP1对大口黑鲈的保护作用,引用信息如下:
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实验结果如下:
1、HRP1基因的序列分析
HRP1基因长423bp,编码140个氨基酸,包括114个氨基酸长的CBS_Pair_SF超家族,无信号肽。鰤鱼诺卡氏菌HRP1的氨基酸序列具有两个CBS结构域,10个可能的配体结合位点I和13个可能的结合位点II。在 HRP1序列比对中,与其他鰤鱼诺卡氏菌物种的序列比对显示出100%的同源性,并显示出与其他参考诺卡菌科物种(在10个诺卡菌科物种中有56.2-73.9%的同源性)和结核分枝杆菌HRP1(47.8%的同源性)相对较高的同源性和相似的结构特征。系统发育树分析表明,该种的HRP1与N. crassostreae的亲缘关系较近,可信度为83%。
 
2、HRP1重组蛋白的克隆、表达和纯化
鰤鱼诺卡氏菌HRP1蛋白编码基因大小为438bp(图A和B),约33 kDa(图C)。SDS-PAGE分析,TRX-Tag蛋白在诱导后的大肠杆菌BL21中成功表达,分子量约为21 kDa(图D)。经Ni-NTA琼脂糖柱纯化后,rHRP1和rTRX的分子量分别为33 kDa和21 kDa,与预测的分子量相近。rHRP1和rTRX都是高度纯化的(图C和D),纯化的rHRP1和rTRX的终点内毒素水平分别为0.504和0.55EU/ml。
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3、rHRP1的免疫原性研究
用感染鰤鱼诺卡氏菌的大口黑鲈血清证实rHRP1的免疫原性。Western blot分析表明,重组蛋白rHRP1的33 kDa条带能与感染鰤鱼诺卡氏菌的大口黑鲈血清(图E)发生特异性反应,但不能与健康大口鲈鱼的对照血清发生反应。
 
4、血清溶菌酶活性
免疫后1-6周,用比浊法测定免疫鱼和对照鱼的血清溶菌酶活性(图1)。rHRP1+ISA免疫组在免疫后2~6周血清溶菌酶活性显著高于阴性对照组(PBS、PBS+ISA、rTRX+ISA)。在免疫后第1周,免疫组和对照组之间无显著差异。免疫组的溶菌酶活性在第4周达到最高(167 mg/ml)。
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5、特异性血清抗体的产生
免疫后第1~6周,用ELISA法检测免疫鱼血清中的特异性抗体效价(图2)。rHRP1+ISA在第1~6周的鱼血清中产生的特异性抗体水平显著高于对照组,其中以第4周的抗体效价最高。但在第1周,rHRP1+ISA组与rTRX+ISA组的抗体产生无明显差异。免疫后4~5周,rTRX+ISA组的抗体水平显著高于PBS组和PBS+ISA免疫组。PBS+ISA免疫的鱼在所有检测时间点的效价均高于注射PBS的鱼,但差异无统计学意义(P>0.05),PBS+ISA免疫的鱼在所有检测时间点的滴度均高于注射PBS的鱼。
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6、免疫相关基因的表达
为探讨对免疫相关基因表达的影响,利用管家基因rsp40和β-actin,采用qRT-PCR分析了上述免疫相关基因在攻毒后24h头肾组织中的表达水平。
相对表达分析表明(图3),与对照组相比,rHRP1+ISA组头肾各基因的mRNA表达水平均显著升高,尤其是IL-1b、IL-8和CCL20(表达量增加了6.0倍以上)、MHCIa、CD8a、INFg和NKEF(表达量增加了3.0倍以上)。结果表明,rHRP1+ISA组头肾组织中IL-1b、IL-8、CCL20和MHCIa、CD8a、INFg和NKEF的表达量均显著高于对照组(P<0.05)。
攻毒后24h,Th17免疫相关基因STAT3、IRF4和RORa较对照组显著上调(变化超过2.0倍)。24h后rTRX+ISA组IL-1b和IgM的表达均高于PBS对照组,但差异无统计学意义。ISA佐剂组也记录到更高水平的IL-1b表达(变化3.0倍)。
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7、针对鰤鱼诺卡氏菌的免疫保护作用
在6周的观察期内,所有组的鱼都存活下来,并且在行为和病理体征上与对照鱼没有差异。PBS对照组的鱼在感染后8d开始死亡,并持续到31d。试验结束时,PBS组、PBS+ISA组、rTRX+ISA组和rHRP1+ISA组的平均累积死亡率分别为75%、68.33%、63.33%和20%,PBS+ISA组、rTRX+ISA组和rHRP1+ISA组的平均累积死亡率分别为8.88%、15.56%和73.33%,与PBS+ISA组、rTRX+ISA组和rHRP1+ISA组的平均累积死亡率相比,PBS+ISA组、rTRX+ISA组和rHRP1+ISA组的平均累积死亡率分别为8.88%、15.56%和73.33%。在攻毒实验中,从濒临死亡的鱼的肝脏、头肾和脾脏中分离到纯菌落的鰤鱼诺卡氏菌,表明该菌的感染是其致死的原因之一,这些结果暗示 rHRP1可作为诺卡氏菌病的有效疫苗。
 
综上所述:可特异性检测到33 kDa的rHRP1蛋白;通过计算相对存活率(RPS)来评价rHRP1的疫苗效力。rHRP1诱导的RPS为对照组的73.33%;qRT-PCR结果显示,rHRP1能显著增强免疫相关基因IL-12p40、IL-8、IL-1b、TNFa、IFNg、NKEF、MHCIa、MHCIIa、CD4-1、CD8a、IgM、NF-Jb、STAT3、IRF4、RORa和CCL20的表达。这些结果表明,rHRP1有可能成为诺卡氏菌病的候选疫苗。

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