对虾微孢子虫聚合酶链式反应（PCR）检测技术的发展 |
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2016-05-10 23:06:00 水产养殖网 出处：曾氏悟语
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近年来，我国沿海养殖业受微孢子虫病困扰，已从东南亚向海南，继而向大陆发展，形式不容乐观。这是我去年10月翻译的一篇来自美国学者的论文，该论文发表于2015年7月。希望能给养殖户带来参考价值。
总结：本文讲到的微孢子虫（EHP）是2006年甚至以前就发现了，起源于东南亚，有蔓延的趋势，感染后无明显临床症状，只能依靠聚合酶链式反应（PCR）分子生物学的方法检测，可检测出对虾组织（主要存在于肝胰腺组织中）、排泄物（粪便）和水体中的EHP。但这一技术还不成熟。所以很难判断是否感染了EHP。建议使用活饲料，注重养殖池的环境。本文主要讲述PCR技术检测EHP的方法，以及检测到的EHP的形态特征。
根据越南境内的鱼塘数据（虾农个人提供的数据）：把感染后的虾苗放入虾塘后的前25天时间内，对虾生长速度正常，之后，对虾的健康状况开始恶化；受感染的对虾饲料进食量减少（50-70%），肝胰脏变色。对虾每天的死亡率约为1-2%。发现，在某些情况下，EHP通常伴有弧菌机会性感染（也称为感染性肝胰腺坏死），这可能会导致增加对虾死亡率。
译文（节选）（原文就不提供了）：
微孢子虫
聚合酶链式反应（PCR）检测技术的发展
来源：美国，亚利桑那州85721，亚利桑那大学，动物与比较生物化学学院，水产养殖病理学实验室；
越南，胡志明市，农林大学，渔业学院，水产养殖病理学系
发表于2015年7月3日
关键词：虾病，对虾肠孢子虫，微孢子虫，原位杂交，聚合酶链式反应
摘要：
对虾肠孢子虫（缩写为EHP），是一种微孢子虫寄生虫，寄生在对虾体内的新兴病菌。在亚洲的一些对虾养殖国家中都已经出现了EHP，包括越南，泰国，马来西亚，印度尼西亚和中国。据报道，EHP造成了养殖虾的生长延迟。我们对越南和文莱的感染对虾的组织结构进行了检测，发现性嗜碱性包涵体存在于肝胰腺肾小管上皮细胞中。在肾小管上皮细胞中，我们发现从原质团到成熟的孢子的不同发展阶段中都存在有EHP。通过对18srRNA进行PCR技术鉴定，EHP的一条长1.1kb的18srRNA基因片段被放大检测，结果证明这一序列与泰国和中国对虾中的EHP序列相吻合。我们复制了这一片段，将digoxigenin-11dUTP标记复制片段，并与凡纳对虾（越南）和红额角对虾（文莱）的组织切片进行原位杂交。原位杂交的结果显示，探针仅对细胞质内含物中的EHP感应，而对类似匹里虫的感染棉虾病的微孢子虫没有感应。随后，我们对18srRNA基因区域做了进一步的PCR检测，结果显示探针对其他两种寄生病菌，一种变形虫和棉虾病微孢子虫的EHP没有感应，对不同甲克类动物，包括多毛类动物，鱿鱼，螃蟹和磷虾的基因组DNA的EHP也没有感应。我们从感染过的虾槽中取样，通过PCR技术鉴定，在样本的肝胰腺组织，排泄物和水中检测到了EHP。
简介：
据报道，东南亚的海产虾养殖场的库存量严重影响了对虾的数量增长，人们发现被感染池塘里的对虾都感染了微孢子虫，对虾肠孢子虫(EHP)(Tourtip et al.,2009;Sritunyalucksana et al.,2014),一种寄生在对虾体内的寄生虫。在黑虎虾斑节对虾和南美白对虾凡纳对虾也感染了EHP病菌。EHP感染给经济带来了巨大的损失，目前人们认为EHP是对虾养殖业的重大威胁。尽管EHP对对虾养殖场的影响非常大，但是在过去的两年里，由于恶性的病菌性疾病，急性肝胰腺坏死（AHPND,也被称为早期死亡综合症，EMS）引起的死亡数给养殖场又蒙上了一层阴影。尽管虾农们通过提高检测技术和养殖场管理来尽力降低病菌疾病的恶劣影响，EHP感染的亚致死现象还是很明显。然而，AHPND流行的阶段，EHP就很难被检测出来；结果，这种病菌就在越南，中国，印度尼西亚，马来西亚和泰国（Haet al.,2010）的养殖场中广泛传播。
感染EHP没有明显的临床症状，现在可以通过组织学检查，原位杂交和PCR技术诊断出来（Tangprasittipap et al.,2013）。EHP是一种细胞内可以产生孢子的寄生虫，它会在肾小管上皮细胞的细胞质区繁殖。研究组织感染的组织学揭露了这种寄生虫的几个发育阶段，包括早期多核病原体和成熟孢子阶段。这种病原体是多核的，成熟孢子是椭圆形的，长度是0.7-1.1微米。孢子包含一个单核，5-6圈极丝，一个后极泡，一根固定在极丝上的固着盘和一个高电子密度的壁(Tourtipet al.,2009)。
由于EHP在对虾养殖场中非常普遍，所以有必要开发具体、高效的诊断方法来检测病菌，发展管理策略。最后，我们应用PCR技术，放大EHP的18SrRNA基因，再用标记地可辛的探针探测原位杂交细胞中被感染的EHP，最后开发新的PCR技术探测对虾组织，排泄物和水中的EHP。
2.材料和方法
2.1对虾
2006年在文莱收集了感染对虾肠孢子虫（EHP）的南美兰对虾。2014年和2015年在越南虾塘里收集了感染EHP的南美白对虾。2014年，从泰国运送了一批南美兰对虾到我们亚利桑那大学的实验室进行隔离检测，这些对虾后来被检测出感染了EHP，它们的肝胰腺，排泄物和水进行了PCR技术取样检测。
为了检测原位杂交（ISH），并通过PCR技术分析EHP的特异性，研究人员使用了具有棉虾病临床症状的斑节对虾样本，这些对虾来自2005年（固定组织）和2006年（冰冻组织）的马达加斯加。还使用了感染了鳄组织变形虫的南美白对虾，这些虾是在2014年收集到的。通过PCR技术分析，肝胰腺组织或者整只对虾被保护在95%的酒精当中或被风干后送往我们实验室。通过原位杂交技术，用戴维森固定法将虾固定。
2.2.DNA提取
从感染EHP的对虾中去除肝胰腺，（4-5只虾）放进一个样本中。装运感染EHP的对虾的虾槽中对排泄物和水进行了取样。利用MicrosepAdvance离心装置（PALL公司）将虾槽里的水浓缩150倍，用于DNA提取。用一种高纯度DNA模板制备工具（RocheBioscience）或Maxwell-16Cell LEV DNA纯化试剂盒（Promega）。
为了测试EHP引物的特异性，PCR扩增检测两种寄生虫病中的DNA：
（1）棉虾病，2006年从马达加斯加收集了斑节对虾，这些虾的肌肉变白，通过rRNA基因测序，发现它们的DNA呈阴性，因为内有类似于匹里虫的微孢子虫（GenBankkp825331号）；
（2）变形虫病，这些南美白对虾大量死亡，通过组织学检查，最后发现这些虾感染了变形虫（种类不确定）。
为了保证EHP引物没有宿主基因组的反应，制备DNA模板：
（1）来自美国夏威夷的无特定病原（SPF）的南美白对虾（>10样本）、斑节对虾（3个样本）；
（2）来自沙特阿拉伯的印度对虾（2个样本）；
（3）在新喀里多尼亚养殖的南美兰对虾（2个样本）；
（4）来自菲律宾的罗氏沼虾（2个样本）；
（5）沙特阿拉伯附近虾塘里采集的蟹（7个样本，未知的物种）；
（6）多毛类（3个样本），卤虫生物量（9个样本），鱿鱼（2个样本），磷虾（2个样本），这些是从各种商业供应商运送。
2.3.18S rRNA基因扩增和克隆
PCR检测技术，使用了PuReTaqReady-To-Go珠（GE医疗）。扩增18SrRNA基因的引物18S-F（5’-CACCAGGTTGATTCTGCCTGA）和18S-R（5’-TCTGAAATAGTACGGGCGG）。PCR反应中包含200微米dNTP，0.2微米引物，10mM Tris-HCl（pH9.0）,50毫米氯化钾，1.5毫米氯化镁，2.5U Taq DNA聚合酶和1微升提取的DNA（10纳克至100纳克每微升）。放大进行下列循环参数：到达94°C进行初始化3分钟，然后94°C温度下进行30秒，55°C温度下进行30秒，72°C温度下进行1分钟，做35个此循环周期，并在最后一个周期停留在72°C温度下5分钟。在一个含有溴化乙锭的1.2%琼脂糖凝胶中电泳分析PCR产物。在〜1KB一带切除和提取DNA，克隆到pGEM-T-easy载体（Promega）上，命名为克隆pEHP-1。通过DNA测序，克隆的插入为1146bp（GenBankNo.kp759285）。国家生物技术信息中心（NCBI）使用BLAST序列数据库对GenBank的相似序列进行了搜索。
2.4、探针标记和原位杂交
克隆pEHP-1质粒DNA被用来做成原位杂交时的一个探针。Mari等人描述，在PCR反应中，使用了digoxigenin-11-dutp（Roche）标记的基因探针（1998）。用于标记反应的引物EHP-F（5’-GGGAACGACGAACGGCTCAG）和EHP-R1（5’-TGCCTTGATGAGACACTGTT）产生一个1.1 kb的片段。digoxigenin标记的DNA探针，用乙醇沉淀，悬浮在水中，并存储在-20°C。棉虾病，感染了类似于匹里虫的微孢子虫的探针如微孢子虫，是从一个克隆的16SRNA基因区域产生。
戴维森的AFA固定虾进行了处理，石蜡包埋，按照标准方法切片（4微米厚）（莱特纳，1996）。经过脱蜡，水化，蛋白酶K消化，和后固定，切片浸泡在用500微升的杂交液中（4×SSC，50%甲酰胺，1×登哈特的溶液，5%硫酸葡聚糖，0.5微克/毫升鲑鱼精DNA），这种杂交液中含有EHP探针含（0.2μg/ml）。切片放在90°C加热表面上10min，然后在42°C温度下进行一夜的杂交。最终采用硝基蓝四氮唑，5-溴-4-磷酸进行检测抗地高辛抗体共轭碱性磷酸酶（罗氏）。
2.5.EHP的PCR检测。
PCR检测技术，使用了PuReTaqReady-To-Go珠（GE医疗）。探测EHP的引物是EHP-510F(5’-GCCTGAGAGATGGCTCCCACGT)和EHP-510R(5’-GCGTACTATCCCCAGAGCCCGA)。放大进行下列循环参数：到达94°C进行初始化3分钟，然后94°C温度下进行30秒，60°C温度下进行30秒，72°C温度下进行30秒，做35个此循环周期，并在最后一个周期停留在72°C温度下5分钟。
3.结论与讨论
3.1临床症状与EHP感染史
目前，养殖对虾过程中所发生的EHP感染还没有特定的的临床症状。EHP感染通常与发育不良和死亡率上升有关。根据越南境内的鱼塘数据（虾农个人提供的数据）：把感染后的虾苗放入虾塘后的前25天时间内，对虾生长速度正常，之后，对虾的健康状况开始恶化；受感染的对虾饲料进食量减少（50-70%），肝胰脏变色。对虾受到感染之后，其体型（即重量，每周进行一次称重）仅为健康对虾的10-40%。对虾EHP感染死亡率并非一成不变，根据养殖场统计，对虾每天的死亡率约为1¬2%。在实验室测定过程中，对虾EHP死亡率并无显著上升，（Tangprasittipap，2013），由于测定持续周期较短（7天），有可能无法检测出死亡率的大幅变化。情况较为严重的EHP感染可能会增加其他细菌感染的易感性。我们发现，在某些情况下，EHP通常伴有弧菌机会性感染（也称为感染性肝胰腺坏死），这可能会导致增加对虾死亡率。
本文从越南搜集了感染EHP的南美白对虾作为组织学检查样品，结果，研究人员在其体内发现嗜碱性包涵体，这种物质主要位于肝胰腺细管上皮细胞的胞浆内（图1A）。这些夹杂物主要出现在疟原虫阶段；此外，研究人员还发现了成熟的嗜碱性孢子。
图1是受感染对虾的H&E组织图（迈尔-贝内特苏木精和曙红荧光桃红）以及EHP的原位杂交组织在。
（A）南美白对虾经过H&肝胰腺组织染色后的状态。箭头表示成熟的孢子，星星表明疟原虫阶段；
（B）EHP探针延续部分的原位杂交。深蓝色沉淀物表明存在EHP。
（C）H&E P优化染色；
（D）EHP探针原位杂交。
（E）H&E对斑节对虾体内匹里虫属微孢子虫引起的棉虾病尾肌进行染色；
（F）与EHP探针进行原位杂交（插入照片F）：与匹里虫属微孢子虫进行原位杂交。
比例尺=25μm（读者可以参考本文的网络版本来了解图例颜色的含义）。
3.2 EHP18S核糖体核糖核酸（rRNA）的基因增殖与序列分析
研究人员从越南搜集受到EHP感染的对虾，并且针对这些对虾体内18SrRNA基因的聚合酶链式反应进行了研究。研究发现了A1146bp基因片段。同源性分析结果显示对虾体内96-100%的身份信息与来自中国和泰国的EHP18S rRNA基因相同（基因库编号:KF362129，KF362130，FK496356，KP027539）；此外，对虾体内93%的身份信息与细胞核内的微孢子虫相同，87-88%身份信息与到其他微孢子虫相同，其中包括Nucleosporacyclopteri和Enterocytozoonbieneusi，82-83%的身份信息与Enterscytosporaartemia相同。
3.3 EHP原位杂交
人们主要养殖三种对虾，其中包括南美白对虾，细角对虾和斑节对虾。通过组织学研究与原位杂交研究，人们发现这三种对虾都已感染EHP。（Tourtip，2009；Tangprasittipap，2013）。原位杂交更为敏感，适用于病原体检测；如果无法通过组织学研究发现细胞的夹杂物或微孢子虫，研究人员可以选择原位杂交进行观察。在研究过程中，克隆的18SrRNA基因片段被标记为地高辛，主要用作受到EHP感染的南美白对虾的原位杂交探针。探针能够对细胞质内的嗜碱性夹杂物产生强烈反应（图1B）。研究人员于2006年从文莱搜集到的南美兰对虾样本也表明肝胰腺内存在微孢子虫孢子（图1C），而肾小管上皮细胞可以在孢子中通过原位杂交的方式产生阳性反应（图1D）。在以上两种情况中，肝胰腺是唯一能够接触到EHP探针的组织。此外，H&E组织学研究中所发现的损伤与原位杂交的结果存在一定的关联。南美白对虾EHP感染样本的研究结果与Tangprasittipap等人所描述的结果相似。（2013）。来自文莱的EHP感染南美白对虾样本的诊断结果表明从文莱也表明亚洲渔场从2006年，甚至2006年之前，就已出现EHP。
探针的应用范围有限。针对那些无特定病原的对虾（没有相应数据），研究人员尚未发现探针与对虾体内的任何组织产生反应。对于感染棉虾病的斑节对虾而言，其尾肌会出现匹里虫属微孢子虫，而这些微孢子虫中的孢子呈嗜酸性。（图1E）。研究人员决定采用EHP探针进行研究，但是在研究过程中，EHP探头没有对感染棉虾病的斑节对虾产生任何反应（图1F）。
研究人员从患有棉虾病的对虾身上克隆出了被标记为地高辛的18SrRNA基因片段（1.1kb），该基因片段主要用于原位杂交。该探针可以探测病斑节对虾是否患有棉虾病（见插图1F）。根据SSUrRNA基因系统发育（Stentiford，2013），18SrRNA基因片段中94%的身份信息与匹里虫属相同，与Enterocytozoon属差别较大。这也解释了为什么EHP探针没有对患有棉虾病的微孢子虫产生交叉反应。
图2，通过聚合酶链式反应检测南美白对虾肝胰腺组织，粪便以及生活水域中的对虾肠孢子虫。M：1KB分子量梯状标记。对那些从越南搜集到的南美白对虾进行聚合酶链式反应检测（VN）（第1列为2014年样本，第2列为2015年样本）对那些从泰国搜集到的南美白对虾进行聚合酶链式反应检测（TH）（第3-5列分别代表肝，粪便和水）。对那些患有棉虾病的斑节对虾进行聚合酶链式反应检测（第6列），对带有变形虫的南美白对虾进行检测（第7列），为无特定病原（SPF）的南美白对虾进行检测（第8列）。对2015年搜集到的卤虫生物样本进行检测（第9列）。HP:肝胰腺。
3.4 EHP聚合酶链式反应
研究人员从感染EHP的18SrRNA基因片段中选出EHP-510F/R引物，从感染EHP的对虾中提取出基因，并且通过聚合酶链式反应的对其进行检测。结果表明，聚合酶链式反应可以检测出发生感染的南美白对虾（图2中第1列和第2列分别代表2014和2015年从越南搜集的对虾，而第3列代表2014年从泰国搜集的对虾）。那些从感染的虾池中搜集的水样和粪便同样感染了EHP（图2，第4列和第5列）。这些EHP引物没有与感染棉虾病的匹里虫属微孢子虫产生交叉反应（图2，第6列），也没有与感染的变形虫产生反应（图2，第7列）。
18SrRNA基因的引物没有与南美白对虾（图2，第8列），斑节对虾，对虾，细角对虾和罗氏沼虾的基因组产生反应（数据未显示）。在亲虾养殖过程中，对虾通常食用多毛类生物，鱿鱼，以及卤虫，这些微生物可能携带EHP，事实也正是如此，研究人员通常在这些微生物身上发现EHP。聚合酶链式反应的检测结果表明EHP引物不会与多毛类生物，鱿鱼，以及卤虫的基因产生反应。研究人员还测试了螃蟹的基因，这些螃蟹主要来自养虾池。研究结果表明EHP引物没有与甲壳类动物产生反应。
出乎意料的是，研究人员在9个卤虫冷冻样本中发现其中4个感染EHP。（图2，第9列，代表性样本）。从感染EHP的卤虫中，研究人员对18SrRNA基因进行了扩增和测序。1.1kb基因片段中99.9%的身份信息与来自越南且感染EHP的样本是相同的（2个核苷酸不同），这表明卤虫携带的EHP可能源自东南亚。感染EHP的4个卤虫样品来自同一个私人供应商，这些卤虫可以来自同一地点。EHP感染在对虾养殖过程中可能会继续发生。人们需要创建一个通过建立监督机制，从而控制这种寄生虫并降低风险的有效手段。在这方面，人们可以采用敏感度较高的EHP分子检测方法，此外，在对虾养殖过程中使用活饲料，注重池塘环境也是非常重要的。养殖户无法通过简单的目测来判定感染EHP的对虾，因为对虾没有明显的临床症状。如果无法及时检测出感染EHP感染的对虾，那么EHP可迅速蔓延。通过此次诊断，研究人员发现了基于原位杂交和聚合酶链式反应的检测技术具有一定的敏感度而且适用于养虾池，从而提供了有价值的常规诊断和监测工具，这种工具适用于池塘环境和水产养殖。
总结一下：本文讲到的微孢子虫（EHP）是2006年甚至以前就发现了，起源于东南亚，有蔓延的趋势，感染后无明显临床症状，只能依靠聚合酶链式反应（PCR）分子生物学的方法检测，可检测出对虾组织（主要存在于肝胰腺组织中）、排泄物（粪便）和水体中的EHP。但这一技术还不成熟。所以很难判断是否感染了EHP。建议使用活饲料，注重养殖池的环境。本文主要讲述PCR技术检测EHP的方法，以及检测到的EHP的形态特征。
根据越南境内的鱼塘数据（虾农个人提供的数据）：把感染后的虾苗放入虾塘后的前25天时间内，对虾生长速度正常，之后，对虾的健康状况开始恶化；受感染的对虾饲料进食量减少（50-70%），肝胰脏变色。对虾每天的死亡率约为1¬2%。发现，在某些情况下，EHP通常伴有弧菌机会性感染（也称为感染性肝胰腺坏死），这可能会导致增加对虾死亡率。
翻译：惠州市三宝生物化学科技有限公司 曾燕
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