科学认识弧菌的发生发展及其生态物理的防控措施，促进对虾行业科学发展 |
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2020-08-15 23:16:00 水产养殖网 出处：如东县南美白对虾协会
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如东县南美白对虾协会第359期消息2020年8月15日发布：
目前，我县行业内有些人对弧菌不够全面认识，有的养殖户在拿苗时检测到了弧菌的苗，尽管不携带任何其它病毒病菌，就放弃选择该苗种投放养殖，望菌生畏；有些苗检单位还把是否携带绿弧菌作为苗种检测指标并列入公告公布，误导养殖户，把弧菌对养殖的负面影响扩大化了。为能澄清这些现象，科学理性的认识弧菌，协会再次联线专家，采访了水产行业资深专家海南海壹种苗有限公司董事长王昌翰；江苏省海洋水产研究所副研究员沈辉博士，进行了专题解读。
海南海壹种苗有限公司董事长王昌翰：
弧菌是海洋细菌的优势类群之一, 广泛分布于世界各地各类河口、内湾、沿岸、水体养殖区和外海的水体及沉积物，各种海洋生物体表或体内也常生存着高密度海洋弧菌，在海洋环境中占据着重要的生态地位，具有多种多样的生理、生态功能, 在海洋微食物循环中扮演重要角色，对海洋的营养物的循环起着非常重要的作用。不同海域的弧菌量占比差异较大，表层海水中弧菌数量占可培养细菌数量的10%-20%不等。
在对虾的养殖过程中，不同种类的弧菌的致病性完全不同。同时弧菌是条件致病菌，海水中弧菌种类分布与温度、盐度、溶解氧和酸碱度的相关性则因弧菌种类和季节不同而异。大多数病原性弧菌只有在外界环境条件恶劣、对虾体质衰弱时，才大量繁殖，从而导致对虾弧菌病的爆发和迅速蔓延。研究表明某高盐海水养殖水体中弧菌数量占水体细菌总数的38.71%，但并没有导致弧菌病的暴发，这表明水产动物病害的发生不是有单纯的某一种细菌所引起的，而是水体环境恶劣，水产动物免疫机能低下，微生态多样性减少的共同结果。
弧菌种类较多，实验室常用TCBS培养基培养弧菌,弧菌的蔗糖发酵生物在利用蔗糖后引起pH发生改变，在指示剂（溴麝香草酚兰和麝香草酚兰）的帮助下，呈现黄色--棕色菌落; 其中不能利用蔗糖的种类，则呈现绿色-蓝色菌落。于是有了我们日常说的黄菌和绿菌。黄色菌落绝大部分是无害菌，绿色菌落大部分是有害菌。然而平板培养也有一定的局限性，培养基因品牌的差异而出现生长差异，要明确鉴定是哪一种有害弧菌，最准确的方法是采用PCR扩增的方式。
弧菌在对虾养殖目前没有国家标准，在行业内有一些约定俗成的参考标准，但弧菌在育苗端、标粗端以及养殖端弧菌的参考量是不一样的，因为弧菌在不同系统中的结构和作用也在不断发生改变，不能统一而论。当弧菌总数不超过106cfu/ml，同时弧菌不超过总菌数的5-10%，则相对较为安全，但不同的系统和环节标准是不一样的，弧菌的条件致病受环境影响较大。
在对弧菌病的防治办法上，缺少有效的特效药，而且过度使用杀菌抑菌药物会影响对虾的养殖效果，我们检测到虾体不带任何弧菌的极有可能原因是过度使用了消毒用品或抗生素，破坏生态平衡，降低了机体的免疫能力。建议送检药残，以确保养殖的安全。
因此，最主要的方法还是要从提高虾苗质量入手。首先，虾苗要强壮，这样可以提高虾苗对弧菌病的抵抗程度，加强虾苗的营养；其次是改善水体环境和增加有益菌使用量，苗池可以加大换水频率和量，有益菌和有害菌本就是一种竞争的关系，良好的水体菌相环境也能抑制弧菌的生长，如芽孢杆菌在生长过程中可以分泌出抗菌因子，杀灭弧菌；最后，加强日常管理，通过增氧的办法提高水质的溶解氧，在多日阴雨气候下，要使用一定量的增氧剂，提高水质的含氧量。
因此，要科学地认识和了解弧菌，弧菌是环境中普遍存在的，也是生态系统的重要组成结构，有效控制弧菌的量而不是杀灭弧菌，保持水体生态平衡，加强养殖管理，方能提高养殖成功率。
江苏省海洋水产研究所副研究员沈辉博士：
近期有多方人士向本人咨询对虾苗期是否以生化方法检测弧菌（涂抹TCBS看黄、绿弧菌）的问题，我整理了以下材料，让大家对弧菌及其检测有进一步的了解。
1、弧菌的定义
弧菌（Vibrio）是菌体短小，弯曲成弧形，尾部带一鞭毛的革兰氏阴性菌。弧菌属(Vibrio)广泛分布于河口、海湾、近岸海域的海水和海洋动物体内，弧菌有91种。有研究报道一些可导致虾类发病，如溶藻弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌等。但值得注意的一点，目前“一旦弧菌感染就致病”的观点被过于媒体及行业的宣传过于放大了。实际上弧菌是养殖环境和水产动物体内的正常菌群之一，是环境污染的指示菌，同时也是对虾养殖的条件致病菌（opportunistic pathogen）。大多数病原性弧菌在外界环境条件恶化、对虾体质衰弱时大量繁殖，导致弧菌病的爆发和迅速蔓延，才会使对虾致病。
2、TCBS的作用
TCBS培养基培养出的细菌主要分为绿色、黄色和黑色三种着色，其主要成份和显色原理为：
(1)含有中的蛋白胨、酵母浸粉提供碳氮源、维生素和生长因子；
(2)氯化钠可刺激弧菌的生长；
(3)蔗糖是可发酵的糖类；
(4)胆酸钠、牛胆粉、硫代硫酸钠和柠檬酸钠及较高的pH可抑制革兰氏阳性菌和大肠菌群；
(5)凡是不能发酵蔗糖的弧菌就不产酸，只能利用柠檬酸钠或枸橼酸钠作为碳源，然后生成碳酸盐，使培养基pH升高，在TCBS培养基上都是绿色（或深绿色）；
(6)能够发酵蔗糖的弧菌可以产酸，使培养基pH降低，在TCBS培养基上的颜色就为黄色；
(7)如果菌株能够产生硫化氢，则遇到培养基中的铁离子就会生产硫化铁显示黑色。
不难看出，TCBS培养基主要通过设置盐度（抑制其他不耐盐细菌生长）及发酵生化（是否可利用蔗糖产酸与显色剂反应）来初步筛选弧菌的。而且，在GB 4789.7-2013 副溶血性弧菌鉴定中还需要配合氧化酶、生化鉴定、血清学等一系列的鉴定才能确认是否是副溶血性弧菌，甚至是否是弧菌，因此TCBS平板法来做为弧菌检测的参考存在不严谨性。
3、TCBS在虾池中应用的可行性
有研究者利用TCBS培养基分离筛选对虾养殖水体中的细菌，采用 16S rDNA分子生物学方法和Biolog微生物自动分析系统进行鉴定分析。结果显示：以TCBS 培养基分离筛选的60株菌中，采用16S rDNA分子生物学方法鉴定只有 SWG-27、SWG-28、SWG-29为弧菌属，占总鉴定细菌的5%，其他细菌大部分为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillussp.)，分别占总鉴定细菌的36.7%和43.3%；自60株细菌中随机挑选15株作Biolog微生物自动分析系统鉴定，弧菌属细菌也只占很小比例；60株细菌接种于6种不同品牌的TCBS培养基上均可很好地生长。结果表明，TCBS培养基能够培养养殖水体中的弧菌，但其他细菌也能在其上良好生长，利用 TCBS 培养基检测养殖水体弧菌数量的结果值得商榷。
4、弧菌在对虾肠道菌群的作用
弧菌广泛存在于河口、咸水、海水等环境中，大部分都不是有害菌，少部分为条件致病菌。多项研究报道显示，在虾苗阶段其肠道中以弧菌为中心地位，周边以芽孢杆菌、光合细菌、乳酸菌等一系列常规细菌及有益菌共同构成肠道菌群，此时在TCBS涂布会出现黄色菌落甚至会出现绿色菌落，但这时TCBS的结果不具参考性。在对虾在生长过程的后期或对虾濒临发病时，这时其肠道仍然以弧菌为优势菌，周边芽孢杆菌、光合细菌、乳酸菌会显著减少，甚至消失，肠道菌群仅剩下弧菌，这时TCBS常以绿色菌落为主，而此时的TCBS结果具有参考性。
5、本研究室上半年的跟踪实验
本研究室上半年对我研究室检测的虾苗进行了TCBS弧菌的监测，但并未告知养殖户，在养殖期快结束时，我们将绿色菌藻10000cfu/g以上的养殖户进行电话回访，得出的反馈为基本未出现异常。回访结果进一步验证了以上结论。
综上所述，弧菌是条件性致病性细菌，具有一定的潜在风险性，但并不代表一定会发病（AHPND/EMS除外），而且目前市面采用的TCBS的检测方法存在不严谨性，参考性不足。因此，科学认识弧菌，理性看待虾苗的检测是保证对虾行业健康理性发展的重要保证。
根据专家的解读，我们认为：弧菌在生物体内、养殖环境中普遍存在的正常菌群，有有益弧菌和有害弧菌之分，有害的绿弧菌超过一定的含量才对养殖产生影响，是条件致病菌，外界环境条件恶化，对虾体质差弱时才能导致病菌爆发。因此，弧菌不可怕，可防可治可控。
协会友情提醒养殖户：
养殖户选择虾苗时，当你遇上虾苗检测不到弧菌或弧菌的总菌量极低的虾苗，这是一种很不正常的现象，疑似或暗示苗种生产单位可能使用抗生素等药物。建议不要选择采购此类虾苗投放养殖。
协会友情提醒相关虾苗检测单位：
你们帮养殖户进行弧菌检测，这是你们业务服务需要，行业协会不加干涉，但你们把检测弧菌指标正常含量的结果公告公布，值得商确。个别检测单位那种以免费为养殖户检测弧菌为借口，实为向养殖户推荐自己的药品，这种做法是不对的。不要误导养殖户，建议更多一点向养殖户正面宣传和引导，科学认识弧菌的发生发展及其生态物理的防控措施。从而促进对虾行业科学、健康、高质量发展。
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