论文解读--透明虎皮鱼作为一种鱼类模型分析诺卡氏菌体内感染 |
| 出处：水生动物健康评估公众号 作者：王文基 水产养殖网 2020-04-06 22:56:00 |
诺卡氏菌侵染多种养殖鱼类，给养殖业造成了巨大的经济损失，但由于对疾病发病机制缺乏详细的认识，阻碍了有效防控策略的制定。自1963年阿根廷首次报告鱼诺卡氏菌病以来，对该病的研究主要集中在流行病学方面，目前还没有广泛有效的方法在感染早期能够被发现或控制。鱼类在发育早期通常是透明的，这一特性已被用于实时研究。如果用一种透明的鱼来研究鰤鱼诺卡氏菌侵染的过程，将能更好的理解鰤鱼诺卡氏菌的致病机理。今天，和大家一起学习一篇用透明的虎皮鱼来研究鰤鱼诺卡氏菌的致病机理，引文信息如下：
鱼诺卡氏菌病是一种慢性感染性疾病，通常在发病初期并不伴有急性症状，但逐渐的组织侵犯最终会在肾脏、肝脏和脾脏等内脏器官形成结节性病变。由于水产养殖中无早期可见症状，病程较长，往往在养殖中期才发现诺卡菌病，由于投入了大量的设置成本和劳动力，且药物疗效较差，给养殖者造成了巨大的经济损失。文章前期研究获得一种突变型的虎皮鱼，这种鱼缺失色素细胞，全身透明。而且在相关研究中表明这种鱼对鰤鱼诺卡氏菌也是敏感的，因此文章借助这种特殊的鱼，在体内研究鰤鱼诺卡氏菌侵染宿主的动态过程，并通过观察了解肉芽肿的形成。
技术路线如下：
实验鱼共分成六组，每组20尾鱼。利用生理盐水调整菌液浓度为1.0 × 106, 1.0 × 107, 和 1.0 × 108 cfu/ml，每尾注射0.05 ml菌液，对实验鱼进行肌肉注射（三组）或腹腔注射（三组），每尾注射0.05 ml菌液，对照组注射等量的无菌生理盐水。腹腔注射后，通常在感染后8天，肌肉和内脏出现肉眼可见的稀疏分布的点状浑浊。这些不透明结节常见于腹腔、脊柱和鳍基周围的肌肉组织，特别是头部肾脏和肾脏区域（图1B,1C）。肌肉注射也导致了白色不透明病变的形成。感染后6 ~ 8天，注射部位附近逐渐出现白色浑浊，病灶体积扩大，与周围组织对比增强（图1D）。
图1 鰤鱼诺卡氏菌感染虎皮鱼的症状
在光学显微镜下，湿式贴装法和Ziehl-Neelsen染色法收获的病结节显示大量的红色细菌丝。
图2病灶中大量鰤鱼诺卡氏菌聚集
类似的白色不透明结节也出现在注射部位外，特别是腹腔内。累积死亡率随细菌剂量和时间的增加而增加(图3)。细菌生长和形态特征与从死亡鱼中分离出的感染性细菌一致，经16S rRNA测序确认为鰤鱼诺卡氏菌(N. seriolae)。肌肉注射比腹腔注射能更快地引起症状的出现和死亡。
图3不同剂量连续感染鰤鱼诺卡氏菌的虎皮鱼实验累积死亡率
注射后12小时，从腹腔流出的腹腔液细胞内发现荧光细菌。部分细胞被GFP标记菌吞噬，呈现伪足和颗粒状结构(图4A和B)，具有白细胞特征。这些结构特征与红细胞特征不同，表明入侵细菌被白细胞(如巨噬细胞)内化。细胞内荧光细菌数量逐渐增多。感染后4天，腹腔内聚集了感染N. seriolae的白细胞(图4C)，并在血液中观察到它们(图4D)。虽然可以被虎皮鱼的白细胞吞噬，但不能完全消灭，部分细菌仍能在细胞内增殖，导致免疫细胞进一步聚集。荧光标记细菌在血源性白细胞中的存在也表明内化细菌可以通过循环侵入其他组织，这可能是多器官病变最终出现的原因。在感染后期，在肌肉、脾脏(图4E和F)、肾脏等组织中发现与体内白色浑浊病变位置相同的标记菌群，表明感染与白细胞分布密切相关。
图4 在虎皮鱼体内追踪被荧光标记的鰤鱼诺卡氏菌
受感染的鱼在肌肉、肝脏、脾脏、肾脏和肠道等多个器官表现为肉芽肿，坏死核心，无明显的组织偏好。肉芽中心干酪样坏死较明显，纤维细胞和上皮细胞层较不明显，尤其在感染剂量最高的组别。
图5 鰤鱼诺卡氏菌感染虎皮鱼后多器官出现肉芽肿
注射标记细菌后，在冰冻切片上更详细地检查了N. seriolae的组织分布。再次，在肌肉、脾脏、肠、肾和肝脏中检测到gfplabnocardia。标记菌呈线性相关，分枝明显，生长呈珊瑚状，并逐渐向外周扩散。
图6 鰤鱼诺卡氏菌聚集形成肉芽肿
本研究表明，细菌的胞内增殖和感染相关免疫细胞的聚集表明，虎皮鱼与宿主细胞的相互作用与分枝杆菌感染相似。诺卡菌可通过血液循环迁移并在鱼体内形成肉芽肿性病变。虽然似乎没有优先感染的组织，但肝组织肉芽肿结构比脾和肾少，这可能是因为后者是白细胞的主要存储器官。肉芽肿核心坏死，周围上皮样细胞很少，纤维细胞层很薄，病理特征与感染分枝杆菌的鱼不同。由于感染源、宿主和感染方式不同，病理表现也有明显差异，因此影响感染过程的因素值得进一步研究。
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