肖述，符政君，张跃环，喻子牛
（中国科学院湛江海洋经济动物实验站 广东 湛江 524001）
摘要：对我国南方海域分布的熊本牡蛎人工繁育技术研究结果表明：熊本牡蛎繁育周期较香港牡蛎长，每年4月到10月共6个月繁殖时长；幼虫培育以单一云微藻全程投喂，各阶段发育正常，并最终能完成正常变态；熊本牡蛎对苗种繁育密度具有较高敏感性，6日龄前（壳高低于150µ）繁育密度以10个/ml实验组生长最快（壳高148.22µ±6.98）、成活率最高(68.43%±13.56)，壳顶中后期以密度为5个/ml实验组表现最佳；盐度实验表明，熊本牡蛎具有广盐性，15ppt-30ppt都可以进行该牡蛎苗种繁育，生长与成活率结果表明最适盐度为20-25ppt。
关键词：熊本牡蛎；人工繁育；盐度；密度
熊本牡蛎（Crassostreasikamea）在分类上属于软体动物门（Mollusca）、瓣鳃纲（Lamellibranchia）、翼形亚纲（Pterimorpjia）、珍珠贝目（Pterioida）、牡蛎科（Ostreidae）、巨蛎属（Crassostrea）。该牡蛎曾经被认为是长牡蛎（C.gigas）的一个地理亚种；后来通过杂交亲和试验、细胞染色体技术、同工酶技术等初步认定熊本牡蛎应当归类为独立物种[5,7]；借助分子标记技术的发展进一步厘清了熊本牡蛎的分类地位[6]。熊本牡蛎是一种广温、广盐性经济型种类，长期被错误认为只存在于日本（日本南部九州岛屿的熊本县有明海湾）。此后有部分学者推测韩国以及我国部分海域均有分布[11]。现已证实该牡蛎我国主要分布区为广东、江苏、广西以及福建等地[1,3,8,10]。
熊本牡蛎不仅肉质鲜美、营养丰富，市场价值高，而且具有不同于其它牡蛎的优良特性——产品上市不受性腺发育影响，可填补牡蛎繁殖季节市场优质产品的空缺。但因该牡蛎个体较小，产量较低，在我国重视产量的年代一直未能引起足够关注，有关熊本牡蛎苗种繁育的研究工作屈指可数[2-3]。本世纪初，熊本牡蛎养殖在美国已得到产业化发展，产品满足其国内市场的同时甚至出口到了日本。2008年日本亦开始了苗种人工繁育和规模化养殖工作，冀望将熊本牡蛎打造成其特色养殖产业[11]。随着国际同行对该牡蛎价值的进一步挖掘，同时国内市场对稀缺性高品质牡蛎的扩大需求，熊本牡蛎苗种繁育及规模化生产等相关研究工作在国内显得重要而迫切。特别是近年来北方太平洋牡蛎深受夏季死亡困扰，广东、广西的香港牡蛎种类也常在冬末春初遭遇不明原因大规模死亡，此种背景下，发展熊本牡蛎的人工繁殖技术研究对于优化牡蛎产品结构、提升产品价值、保护牡蛎产业均衡、稳定发展等都具有十分重要的意义。本研究诣在探索性展开人工育苗实践，为后续全面展开熊本牡蛎工厂化人工繁育及其相关研究工作提供参考。
1. 材料与方法
1.1 亲贝收集与性腺同步促熟
分别于2012年4月、7月、10月在湛江坡头区乾塘镇三窝收集熊本牡蛎亲本每次约30kg。2个小时内将亲本移往湛江东海岛“中科院热带海洋经济动物实验站—东南实验基地”。经表面清洗干净后，挑选优质个体笼养于室内水泥池促熟。每次选用亲本约100个，亲本壳高范围4.5-6.8cm，壳长3.4-4.2cm。促熟期间，采用自然海水，水温28.0—30.0℃，盐度25—26ppt，pH为7.5—8.2，投喂混合单细胞饵料（云微藻Chlorella sp.、金藻Isochrysis zhangjiangensis、角毛藻Chaetoceros sp），其它按照正常管理。
1.2 受精、孵化
在室内水泥池中经性腺同步化培育7天，解剖法受精，卵细胞经过500目筛绢网过滤，除去破碎的组织块团，置于50L事先处理好的盐度梯度海水中(温度：30℃；pH：8.1)，浸泡10-20分钟后（具体浸泡时间依卵细胞成熟度来判断）。然后解剖雄性个体，精子活化5分钟后进行人工授精。并在盐度25ppt、温度30℃条件下进行受精、孵化。
1.3 密度与盐度梯度培养
1.3.1密度梯度培养
孵化出的幼虫，部分以5、10、15、20个/ml 的幼虫培育密度培养于100L聚乙烯白桶，设置3个重复。全程投喂云微藻（Chlorella sp.）。
1.3.2盐度梯度培养
另一部分幼虫置于4个不同盐度梯度培养系统中，盐度设置分别为15、20、25、30ppt。实验均在100L白色聚乙烯桶中进行，每个盐度验设置3个重复组。幼虫进入15ppt系统前经20ppt过渡培养1天避免盐度差异太大导致结果偏差。
1.4 测定指标
受精以释放极体为统计依据计算受精率；孵化率为D形幼虫数与受精卵数量的百分比；幼虫存活率为每次测量存活个体数与D形幼虫数的比值；变态率为稚贝数与足面盘幼虫数量的比值。幼虫的壳高在10×目微尺下测量，测量时每次随机抽取30个个体。
1.5 数据处理
用SPSS16.0统计软件对数据进行分析处理，不同实验组间数据的比较采用单因素方差分析方法（LSD），差异显著性设置为P＜0.05。
2. 结果
2.1 受精、孵化
熊本牡蛎刚解剖出的卵呈梨形，经20min浸泡成熟后，卵径大小为50±2.15μm。孵化水温30.5℃、盐度25ppt。经15h发育成D形幼虫，消化系统开始发育，20h后显微镜观察可见体内消化系统发育充分，表明可以开口投喂。2012年4-10月份范围3次（4月、7月、10月）人工繁育均获得成功，且受精与胚胎发育正常。胚胎发育过程及其变化特征见表1、孵化及幼虫存活结果见表2。
表1熊本牡蛎的胚胎及胚后发育
表2 孵化、变态及存活
2.2培育密度对幼虫生长及存活的影响
不同的培育密度（5、10、15、20）下，d=20个/ml实验组幼虫生长显著小于其它密度组（P＜0.05），6日龄内d=10个/ml密度组幼虫生长最快（壳高148.22µ±6.98），但与d=5个/ml、d=15个/ml的实验组幼虫生长差异不显著（P＞0.05）（图1）。9日龄后d=5个/ml实验组生长最快。相比生长速度，密度对幼虫存活率影响更大，从壳顶期影响尤其显著：5-15个/ml实验组存活率显著高于20个/ml实验组（P＜0.05），其中，d=10个/ml组9日龄成活率高达68.43%±13.56，d=2 0个/ml 实验组在12龄壳顶后期全部死亡，未能发育至变态阶段（图2）。d=5实验组，15日龄时成活率最高（36.88%±9.88）。
图1 示不同密度对幼虫生长（壳高）影响
图2 示不同密度对幼虫成活率（%）影响
2.3盐度梯度对幼虫生长（壳高）与存活的影响
spss多重比较结果如表3，可以看出不同盐度组生长速度存在差异，20ppt、25ppt两个处理组生长较快，两组内无显著差异，但与15ppt、30ppt盐度组存在显著差异（见表内同行间字母差异）。从表4看出不同盐度处理下成活率差异，15ppt、20ppt、25ppt成活率较高，3日龄成活率20ppt试验组达95.32%，成活率最高；9日龄成活率25ppt试验组最大（成活率为81.77%）；15日龄成活率20ppt试验组最大（成活率为73.85%），从表可看出，15日龄成活率最差的为15ppt组，仅为50.55%。
表3. 不同盐度处理组幼虫壳高生长
表4. 不同盐度处理组幼虫存活率%（×100）
3. 讨论
广东海域熊本牡蛎性腺发育较香港牡蛎早，每年3月份性腺开始发育，4月份可产卵，一年内可多次产卵，每年繁殖周期长达6个月之久（广东每年4月到10月）。但为保证性腺的同步性，在其性腺发育中后期阶段进行室内营养强化，对后期苗种繁育十分有利。营养强化手段与其它牡蛎差别不大。精、卵质量对受精率影响较大，胚胎发育早期相比我国太平洋牡蛎与香港牡蛎略微快速。该牡蛎个体较小致绝对怀卵量较小，生产性大规模繁育时，需要亲本数量大。4月、7月、10月三次育苗实验都获得成功，预示该牡蛎在我国南海地区性腺恢复快，可多4-10月范围内多批次进行人工繁育。另外本实验中全程投喂单一云微藻，未发现熊本牡蛎幼虫明显不适现象，这对我国南方高温多雨、难以培养金藻的地区而言，具有十分重要意义。
熊本牡蛎人工繁育密度对苗种繁育成败非常重要。6日龄前，苗种培育密度从5-20个/ml各密度组都对生长存活无显著影响，早期高密度组生长略好于低密度组，但均无显著差异，这种高密度组生长以及养殖系统稳定性好于低密度组现象，可能与牡蛎聚群生态特性有关，因牡蛎个体小（早期仅60-70µ），因此对环境变化适应能力可能部分依赖于群体大小与密度状况，这在其它贝类的生产实践中也时常有类似发现。但随个体增大（壳高超过150µ），低密度组d=5个/ml逐渐体现出生长优势，成活率高密度组d=20在12日龄阶段死亡率超过95%，可能原因是南方水温较高，随个体快速生长，养殖系统内代谢物含量急剧上升，极容易导致病害爆发，常短时间内就会出现幼虫下沉、死亡现象。因此综合验结果，未来苗种生产在D形阶段可采用高密度培养(d=10)，进入壳顶阶段，逐渐降低密度到d=5，最后壳顶后期、眼点期，可将密度进一步降低。我们随后的盐度梯度实验，采用不同发育阶段密度从10个/ml逐步调整到1-2个/ml，15日龄成活率在各盐度梯度下均得到明显提高。
该牡蛎具有广盐性，幼虫阶段对盐度的适应性反映了其自然分布海区的盐度特点，在我国沿海与香港牡蛎、太平洋牡蛎、福建牡蛎均存在生态位部分重叠，其最适盐度分布区域应介于香港牡蛎与另两种牡蛎之间。盐度梯度实验显示在15ppt到30ppt都可进行人工繁育，生长和成活率结果都表明20ppt、25ppt是熊本牡蛎最适盐度，其次为30ppt盐度组，成活率最差为15ppt实验组，该结果与国外学者研究结论相似[9]。盐度实验部分，为了获得相对稳定的实验结果，我们在不同发育阶段进行了幼虫密度调整，各梯度内始终保持了培养密度一致，因此不会对实验结论造成干扰，但提高了本实验苗种培育变态与采苗成功率。
参考文献
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2. 吕晓燕. 熊本牡蛎人工繁育与长牡蛎单体苗种培育技术研究. [硕士学位论文]青岛: 中国海洋大学, 2013.
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1、来源：南方水产网、南方水产微信公众平台
2、作者：湛江市水产学会
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